Analyse des biofilms sur les matériaux dans les canalisations d'eau

Extraction des biofilms

De nombreux auteurs ont cherché la méthode la meilleure pour décrocher les biomasses sans pour autant nuire à l'état physiologique des cellules. Les méthodes sont généralement basées sur des décrochages mécaniques (grattage) ou aux ultra-sons (cuves ou sondes).



Dutkiewicz et Fallowfield ont comparé trois techniques d’extraction des biofilms :

• agitation avec 4 ml d’eau pendant 15 secondes ;
• agitation avec des billes de verre stérile (0-3 g, 1-5 mm de diamètre) dans de l’eau (4 ml) pendant 15 secondes ;
• grattage de la surface interne de la canalisation dans le sens de la longueur avec une spatule stérile suivi par agitation avec 4 ml d’eau pendant 15 secondes

Les auteurs ont montré que l'agitation mécanique avec de l’eau stérile et des billes de verre était la méthode la plus efficace pour récupérer les bactéries contenues à l’intérieur des biofilms

Les résultats sont toutefois très variables et dépendent de l'expérimentateur, du matériel utilisé et des essais inter-laboratoires ont été menés pour tenter de trouver une méthode standard qui n'a pas encore pu être normalisée.

Les différentes techniques d’analyse

Le comptage direct in situ des bactéries dans les biofilms se fait en microscopie à épifluorescence grâce à l’utilisation de marqueurs fluorescents comme l’acridine orange, le DAPI ou le Bac Light. Les bactéries à activité respiratoire ou considérées comme mortes apparaissent colorées différemment donc faciles à distinguer et à dénombrer. Cette technique est limitée par une pénétration insuffisante des colorants dans les biofilms épais et par la variabilité dans l’aptitude des microorganismes à transporter et à réduire le marqueur fluorescent.

Une autre méthode consiste à décrocher les biomasses fixées et à les analyser au laboratoire. L’utilisation d’enzymes (glucosidases, lipases ou protéases) pour hydrolyser la matrice d’exopolymères permet aussi de libérer les microorganismes. L’évaluation des biomasses libérées se fait soit par culture sur gélose (milieu R2A incubé 7 jours à 22°C), soit par toutes les méthodes de dénombrement et de dosage utilisables telles que la mesure de l’adénosine triphosphate microbien (ATP) par réaction enzymatique en bioluminescence, la microscopie en épifluorescence confocal ou non soit par une méthode d’amplification de l’ADN par Polymerase Chain Reaction (PCR) ou des puces à ADN.

Parmi ces différentes méthodes d’analyse, la culture en gélose a l’avantage de caractériser la cultivabilité des microorganismes. Toutefois, elle n’est pas représentative de la biodiversité des communautés microbiennes présentes puisque seulement 0,01 à 30% des microorganismes des biofilms formés sur les matériaux au contact de l’eau potable sont cultivables.

Quant au dosage de l’ATP qui est rapide, sensible et semi-automatisé, il permet de mesurer exclusivement la biomasse au métabolisme actif mais ne donne aucune information sur les caractéristiques des microorganismes présents et sur leur caractère pathogène potentiel.

La méthode d’amplification de l’ADN est assez sensible avec une limite théorique de détection d'un microorganisme, relativement rapide et automatisable mais elle ne donne aucune information sur la viabilité ou la cultivabilité des cellules.

Méthodes expérimentales

Des méthodes expérimentales ont été développées ces dernières années afin de déterminer les propriétés de croissance microbienne des matériaux au contact de l’eau potable. Il faut souligner que les études disponibles n’ont été réalisées que sur des matériaux neufs, et que l’influence des paramètres liés au vieillissement des réseaux (notamment de facteurs tels que le tartre et la corrosion, dont l’influence sur le développement du biofilm et des organismes indésirables est incontestable) n’ont donc pas été pris en compte. Il est donc nécessaire de conduire des expérimentations complémentaires sur des matériaux anciens, qui permettront de garantir dans la durée la qualité de l’eau fournie par les réseaux.

Ainsi aux Pays-Bas, Van der Kooij et Veenendaal utilisent le dosage de l’adénosine triphosphate (ATP) comme indicateur de biomasse active. L’ATP est utilisée comme indicateur de biomasse active. L’ATP est un composé riche en énergie, qui est présent dans les organismes vivants (en activité). L’analyse de l’ATP permet de détecter des concentrations très faibles de micro-organismes.

Le test BPP (pouvoir de production de biomasse), développé par leur laboratoire (Kiwa), est un test statique sans remplacement de l’eau. Il consiste à incuber dans l’obscurité à 25 ± 1°C des échantillons de matériaux dans une eau potable biologiquement stable (taux de carbone organique assimilable très faible), à laquelle sont ajoutés des sels de potassium et des microorganismes isolés d’eau de rivière.

Le pouvoir de production de biomasse (BPP) des matériaux est déterminé par la somme des concentrations de biomasse active formée sur le matériau (pouvoir de formation du biofilm - BFP) et des concentrations de biomasse en suspension dans l’eau (SBP), après 56, 84 et 112 jours d’exposition. La valeur de BPP, exprimée en picogrammes d’ATP par centimètre carré de surface du matériau testé (pg ATP/cm²) est la moyenne des valeurs obtenues sur la période de 16 semaines du test. Une classification en classes de qualité a été proposée pour les matériaux selon leur pouvoir de formation du biofilm.